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          毛細管電泳分析多肽研究進展

          日期時間:2018-05-21 14:33 文章來源:江蘇蘇力機械股份有限公司瀏覽次數:

          毛細管電泳是一種分離效率高、靈敏度高并且樣品用量少的分析技術。這里綜述了毛細管電泳 技術在多肽分析中的應用,以及毛細管電泳技術與其他技術聯用分析多肽的研究進展,并展望了其發展趨勢。
            毛細管電泳技術發展于20世紀80年代,由于 其具有操作簡單、樣品和緩沖液用量少、分離快速 高效、有多種分離模式等優點,很快成為一種常用 的分離手段??梢杂糜诜治鰺o機離子、小分子、氨 基酸、多肽和蛋白質,甚至是單細胞水平的分析,廣 泛應用于藥物 、生命科學 、環境 等領域。 在過去的幾十年中,科學家不斷的對毛細管電泳技 術進行研究,促使毛細管電泳技術得到快速發展。 現如今,毛細管電泳技術已經成為分析多肽最有吸 引力的工具之一 。
          1 毛細管電泳
          毛細管電泳又高效 毛細管電泳(hpce),是指以高壓電場為驅動力,以 毛細管為分離通道,依據樣品中各個組分在毛細管 中分配行為和淌度的差異而進行高效、快速分離的 一種新型的液相分離分析。
          為滿足對不同類型多肽分析的需求,科學家研 發出多種毛細管電泳分離模式,推動的毛細管電泳 技術的不斷發展和完善。毛細管電泳技術主要有: 毛細管凝膠電泳、毛細管區帶電泳、毛細管膠束電 動色譜、毛細管等速電泳、毛細管電色譜、親和毛細 管電泳、非水毛細管電泳、毛細管陣列電泳、芯片毛 細管電泳等。有些毛細管電泳還可以與其他分析 方法聯用,例如;毛細管電泳-二極管陣列 、毛細管 電泳-液相色譜、毛細管電泳-質譜、毛細管電泳-化 學發光等 。
          2 毛細管電泳在多肽分析中的應用
          2.1 多肽的分離
          隨著分析技術的不斷發展和完善,涌現出很多 分離分析手段。毛細管電泳技術發展較為迅速,應 用領域廣泛,常用于多肽分離。薛洪寶等 利用毛 細管電泳建立了一種簡單、快捷、高效的分析方法, 并利用此法分離了15種氨基酸和2種多肽,獲得了 令人滿意的實驗結果。程燕等[10]通過毛細管電泳 技術分離了16種二肽,并研究了緩沖液濃度及ph 值對二肽衍生物分離的影響。在最優的實驗條件 下,實現了14min內成功分離16種cec二肽衍 生物。
          2.2 多肽的純度鑒定
          對于測定多肽的純度常用的方法是hpc法, 此方法可能存在分析時間長,分離效果不佳,成本 昂貴等局限,因此很有必要開發其他方法對多肽純 度鑒定。宮菲菲等利用毛細管區帶電泳(ce) 方法測定艾塞那肽純度,并初步考查其穩定性。其 純度測定結果與高效液相色譜法基本一致,但此法 的分離效果更好,分析時間短。kang等 用聚二 甲基丙烯酸酰胺動態涂層修飾毛細管,結合p和 短端進樣等技術快速測定了葉酸對應體的純度。
          2.3 多肽的性質研究
          毛細管電泳對多肽性質的研究主要集中在分 子量測定、穩定性研究以及多肽的結構分析。 劉靜等采用毛細管電泳發測定了水解后大 豆多肽的分子量,結果表明,所制樣品分子量主要 分布在8200da以下。廖海明等以葡萄糖為分離 介質,測定了15種蛋白質分子量,其測定結果與平 板sds-聚丙烯酰胺膠電泳(sds-page)測定的結 果基本一致。
          測定多肽組分的方法主要有:高效液相色譜 法、質譜、電泳和核磁共振等。最常用的是反相高 效液相色譜法,但是此法卻存在一定的弊端:對相 對分子質量較小的多肽分離效果不太理想。毛細 管電泳技術具有其他分析方法不具備的優勢,例如 分析周期短、分離方式多樣等。王辰等]利用高效 毛細管電泳法研究了腦蛋白水解產物中的多肽組 分,并測定了進口腦蛋白水解產物注射液的多肽組 分分布。以溶菌酶(相對分子質量為14400)和胰島 素(相對分子質量為6000)為標記物,兩者間的峰為 多肽,進口腦活素注射液中所含組分多數集中在> 14400區域,“強腦素”所含多肽的相對分子質量大 部分集中在6000~14400之間。
          利用hpce分離分析多肽,可以得到多肽的結 構信息。李峰等通過高效毛細管法得到了蜈蚣 藥材的“指紋圖譜”,鑒別了蜈蚣藥材商品的種類, 對其質量進行控制。
          3 毛細管電泳與其他技術聯用分析多肽
          隨著當今科技的快速發展,多種分析技術聯用 的優點已逐漸被人們意識到,比如高效液相色譜-質 譜法聯用技術。隨后,基于毛細管電泳技術與其 他聯用技術聯用的技術相繼被開發出來。人們對 于毛細管電泳技術的研究日益深入,涌現出一些其 他可使用的檢測器,例如激光誘導熒光檢測器,二 極管陣列檢測器等。但是這些檢測器或多或少存 在一些不足。例如在利用毛細管電泳分析多肽類 藥物時,由于多肽類藥物雜質的結構與多肽的結構 非常相近,如果采用單一的分析方法,很難得到滿 意的結果。因此,采取兩種及兩種以上分析原理成 為發展趨勢。近些年國內外者研究了毛細管電泳 技術與其他技術聯用分析多肽,并且得到了令人滿 意的結果。
          3.1 毛細管電泳-質譜
          高分離效率的毛細管電泳與具有優越結構定 性能力的質譜結合,形成ce-ms聯用技術,此技術 已經可以與hplc-ms技術媲美。特別是近幾年 質譜技術的快速發展,尤其是靈敏度的提高,很大 程度上改善了由于ce進樣量小導致檢測靈敏度較 低的缺點。但ce-ms聯用技術在實際的運用中依 然存在很大的挑戰,把ce 與ms 聯用要比把 hpLc與ms聯用困難得多。因為ce一端插入緩 沖液中,而另一端要跟質譜相連。ce的工作必須 有閉合回路,形成高壓電場。這就要求ce和ms 之間不僅要有良好的接觸,更要有高效的離子化效 率。而hpLc與ms可以通過分流技術,使流出色 譜柱的流動相直接與質譜儀相連,離子化之后檢 測,二者之間不需要電的接觸
          ce-ms聯用技術能對多肽雜質進行結構鑒定, 是表征多肽雜質的一種非常重要的分析手段。 hoitink等[21]利用ce-ms法分析了戈舍瑞林在堿 性條件(ph=9)、酸性條件(ph=5)下降解產物的   同時 還做了ce-ms與Lc-ms的對比,結果發現ce-ms 對缺失肽有較好的分離效果。Yu 等[2 3] 利用 hpLc/eSI-ms/ms技術測定了單細胞中的谷光甘 肽。cha等[2 4]采用毛細管柱-電噴霧質譜成功鑒定 了宮頸癌中的237個肽段和163個蛋白質。Rittgen 等[25]用ce-ms分析了Amanita菌毒性多肽。 ce-ms聯用的關鍵因素是接口技術,有離線聯用和 在線聯用兩種模式。ce-ms在線聯用具有更智能 且樣品損耗少的優點,被廣泛研究。Nguyen等[26] 開發了一種新型的ce-ms技術,該技術采用無鞘 液接口,他們證實此技術可有效的用于復雜混合多 肽的分析。
          ce-ms聯用技術用于多肽研究的發展趨勢,主 要取決于ce分析能力的提高以及更高效更靈敏新 型接口的開發。發展毛細管涂層技術,減少毛細管 壁對多肽的非特異性吸附可以有效的提高ce的分 析能力;另一方面要開發各種模式的接口,以滿足 ce-ms技術的發展需求,當今常用的接口技術主要 是自對準負壓混合液的電噴霧接口和無保套的金 屬魯棒性和高靈敏度的樣品定量涂布發射器接 口,這些接口技術遠遠不能滿足ce-ms聯用技 術的發展需求,這也是現階段限制ce-ms聯用技 術發展的因素。因此,開發更多接口技術對ce-ms 聯用技術的發展有重大的意義。
          3.2 毛細管電泳-色譜
          毛細管凝膠電泳是基于分子篩原理進行多肽 的分離。但是此方法在分離多肽時存在一些不足, 例如一次性處理樣品的量少,并且不能進行大量的 樣品收集制備。為了克服這些不足,Dominguez 等[28]等將毛細管電泳技術與hpLc技術聯用,用 于測試capillary-hpLc列和優化分離條件,此方法 提高了大豆多肽的分離效率,為快速分離純化不同 大豆食品中的多肽提供了方法。葉淋泉等探索 了液滴接口二維分離技術,他們以液滴作為接口連 接高效液相色譜與毛細管電泳,分析了蛋白質降解 的多肽混合物,獲得了大于3000的峰容量,豐富了 毛細管電泳-色譜聯用技術形式,擴展了此技術的應 用領域。
          3.3 毛細管電泳-化學發光
          化學發光法是公認比較靈敏的檢測技術[30]。 它是根據被測物質在特定條件下化學發光強度的 不同來定量分析的技術。相比于其他光學檢測方 法,化學發光法不受來自光源雜散光的干擾,很容 易獲得較低的檢測噪聲。將高分離效率的毛細管 電泳技術與高靈敏度的化學發光法聯用形成毛細 管電泳-化學發光法(ce-cL)。ce-cL具有背景信 號地,檢測靈敏;有較寬的線性范圍簡單,可實現定 性分析,廣泛應用于多肽、氨基酸及藥物等領域[31]。 ce-cL技術的關鍵在于cL試劑的引入和檢測界面 的構建。ce-cL 常用的接口檢測模式是柱檢測 模式
          蘇孫煌[34]研制了“毛細管電泳-電致化學發光 檢測器”,該檢測器采用的分離檢測對象為Luminol- NaOh,通過實驗證明該檢測器檢測具有較高的 靈敏度及較好的重現性,可實現對多肽的快速分離 與檢測。Zhou等通過ce-cL聯用技術,氧化石 墨烯作為載體,檢測了病人血清中的癌胚抗原,檢 出限為4.8pgmL-1。此方法解決了在測試過程中 對樣品信號的干擾問題,很大程度上提高了檢測靈 敏度和精度。Zhao等利用Mce-cL方法檢測 了紅細胞內谷胱甘肽的含量,其檢出限為5×10-20 mol。此方法比激光誘導熒光法檢測紅細胞內谷胱 甘肽含量的方法操作更加簡單,靈敏度提高顯著。 毛細管電泳存在蛋白質特異性吸附問題,Liu等 開發了一種動態涂層的ce-cL檢測系統,解決了蛋 白質特異性吸附的問題。聚吡咯烷酮粘度低易溶 于水,很容易進入毛細管并覆于毛細管的內壁。實 驗結果顯示,采用聚吡咯烷酮以后,蛋白質特異性 吸附現象明顯減弱,且此方法具有較好的重復性。 ce-cL聯用技術兼具高靈敏度和高分離效率 的特點,已成為一種高效的分離檢測多肽的方法。 然而ce-cL聯用技術在多肽的分離檢測方面重現 性不太穩定,因為此技術不僅對毛細管電泳技術有 較高的要求,它還受到化學發光反應物流速、反應 物混合模式以及反應類型的影響。ce-cL聯用技 術線性范圍大約只有兩個數量級,目前cL標記 技術也不成熟,這就限制了ce-cL聯用技術的發 展。在未來幾年,ce-cL聯用技術在多肽分析方面 的應用還需在以下方面深入研究:(1)開發新型cecL 聯用儀器接口,提高系統的選擇性、穩定性和靈   敏度;
          (2)ce-cL聯用技術可以和色譜、質譜等方法 聯用,以獲得更好的性能;(3)擴展ce-cL聯用技術 的檢測范圍。
          3.4 毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法 激光誘導熒光檢測器(LIF)運用于毛細管電泳 技術,對毛細管電泳技術的發展具有里程碑意義。 激光誘導熒光檢測器的引用,打破了毛細管電泳檢 測靈敏度不高的限制,使檢測分析靈敏度提升了3 ~4個數量級[39],一般情況下LIF的檢出限比普通 的UV法低很多,并且在一定條件下還可以實現單 個細胞的檢測。因此,ce-LIF聯用技術在生物分 析中具有很大的應用前景
          王宇飛等用毛細 管電泳-激光誘導熒光直接檢測氧化型和還原型谷 胱甘肽及其構成氨基酸。在此之前檢測谷胱甘肽 的方法有很多,但是能夠同時檢測其構成氨基酸的 方法較少。他們的方法能夠快速的實現基線分離, 并且具有檢測線低的優勢。唐敏等利用激光誘 導熒光檢測微流控芯片毛細管電泳技術分離了牛 血清蛋白的胰蛋白酶酶解產物,并分析了多種影響 電泳分離性能的因素,如緩沖液組成、表面活性劑 濃度等,確定了最優實驗條件,取得了良好的實驗 結果。

          毛細管電泳技術用于多肽研究的發展方向仍 然是提高多肽分析的分辨率和速率。為了滿足生 命科學研究日新月異發展的要求,應將毛細管電泳 技術與其他分析技術更好地結合,繼承各自的優 點,摒棄各自的缺點,可以實現更快速、更準確的分 析多肽,同時也能拓寬毛細管電泳的應用領域。



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